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全基因组与外显子组测序在临床诊断中的应用

时间:2016-12-15 07:44 作者:生物观察
 

 

 


全基因组或外显子组测序的临床应用,称为临床基因组和外显子测序( Clinical genome and exome sequencing,CGES)。由于该技术检测范围广,可以同时检测2000多个基因的变异,对于临床罕见病、疑难疾病、复杂疾病,特别是孟德尔遗传病的诊断是一种强大而有效的方法。全基因组测序是针对个体的所有基因序列进行测序分析,测序范围广,数据多,分析困难,专业性强,费用昂贵,目前还难以大规模应用于临床。而外显子组的序列只占全基因组序列的1%,大多数与疾病相关基因变异位于外显子区域,因此,与全基因组测序相比,外显子组测序以其经济有效的优势广泛用于鉴定遗传性疾病的基因变异。但是,由于运用该技术鉴别成因性变异的成功率仅约为25% ,这就使得临床医生了解该技术的基础原理以及如何选择最有可能从中受益的患者显得非常重要,同时还应该熟悉外显子组测序的诊断适应症才能更加有效地运用于临床实践。1、 CGES的局限性CGES是检测单核苷酸替代、插入以及8-10个甚至更少的核苷酸缺失突变的最有效的方法,而对于拷贝数变异、染色体的非整倍体、长插入缺失变异、DNA重复序列等形式的基因变异则没有那么精确。同时,不管是全基因组测序还是外显子组测序都存在测序覆盖率的问题,一般情况下,测序所得出的数据仅能覆盖目标序列的85~95%。因此,即便运用全基因组测序,仍然存在致病性变异漏检的可能。2 、CGES的应用CGES是疑似罕见的孟德尔疾病的最佳诊断方法。当患者已经排除常见的单基因缺陷,同时又考虑到多基因缺陷的检测方法太昂贵时,CGES就是最好的选择。由于很多遗传性疾病都是在童年出现临床表现,因此实施CGES检测的患者是以儿童为主,它不仅可能帮助患者及其家属找到病因和疾病治疗相关方法,同时还可以了解疾病的再发风险。若考虑患者需要做CGES检测,测试前的咨询至关重要。首先,最主要是要确定患者的真实期望,以及提醒患者或者家族成员:阳性的结果并不意味着一定可以改变治疗方案和改善预后[9]。其次,还必须告诉患者,与欲检测疾病不相关的基因突变也可能发现并出具于报告中。在大多数情况下,外显子组测序较单个基因测序更加高效。除此之外,医生还需要准备四个要素:收集家系的信息、系统评估患者的表型、查找医学文献和数据库和签署知情同意书。一份完整的家系可以用于评估家系其他成员中有没有相似或者相关的表型,以确定疾病遗传模式。同时,先证者和家系中的其他患者也必须排除其他的潜在相关的临床表现。当有了一个完整的家系资料、全面的表型特征、相关疾病的文献综述以及数据库,便可以基本明确患者是否是患有罕见的遗传病。那么如何选择家系中的成员进行测序分析呢?这个和遗传模式以及家系中的其他成员是否具有相类似的临床表现有关。当怀疑某个变异是新发异时,患者的双亲通常也要进行相关检测,若患者的双亲证实没有携带相关变异,而他们的亲缘关系是确定的情况下,患者所携带的变异即认定为新发[10]。但是,当主要的遗传条件受到质疑的情况下,患者的父母,兄弟姐妹、甚至远房亲戚都应该检测,这主要取决于家系的特殊性以及家系成员之间的亲缘关系。而在另外一些情况下,如果只针对患儿行CGES检测,随后对患病和非患病的亲属进行基因型分型,如果可以表现出变异和疾病的共分离现象,也可以说明变异的致病性。CGES可以发现已知的致病性变异和以前没有报导过但对人类有明确致病性的基因变异。另外,部分实验室也报告一些新的基因突变,但是并不确定它是否可以引起人类疾病。因此,开展一些基因突变的致病机制研究显得十分必要。3 、CGES的结果评估在部分CGES报告中,可以直接明确疾病的成因性变异;然而,有些报告中基因变异的意义需要由医生和遗传咨询师共同来鉴别。实际上,在大多情况下,报告并没能鉴别出看似合理的突变。评估CGES结果最主要是要考虑到测序和临床的正确性。分析的正确性是衡量患者是否真的携带CGES检测结果中的特殊基因型,是由实验的准确度决定的。而临床的正确性则更复杂,更难评估,这取决于一种特殊的疾病是否是真正由特殊的基因突变所致以及这种突变是否有明确的致病性。CGES的阳性发现往往是非常准确的,但是假阴性率则根据基因组的区域不同而不同。正是这个原因,CGES才一直没能真正替代可疑目的基因测序或者特定条件下优化了的基因panels的测序[11]。大部分实验室验证CGES的阳性结果都是运用PCR扩增和Sanger测序。如果测序公司没有对CGES的实验结果提供实验验证,若要基于CGES结果实施医学干预,那么实施之前都应该运用Sanger测序进行验证。分析CGES数据的一般方法是将基因变异数据和已知的变异数据库比对,进而根据描述了变异和表型关系的文献报道分析。然而,在临床医生综合分析测序结果时,应该充分了解和疾病发生无关的变异,同时认识到由于CGES测序是同时测出成千上万基因的序列,所以测序结果出现错误归因的概率是较高的。明确疾病特异性基因变异主要的临床意义是对过去难以诊断的复杂疾病或遗传疾病进行诊断。有时,病因明确后可以给出特殊的治疗策略并对临床预后产生预想不到的改变。而在大部分情况下,致病基因的发现并不能改变临床的治疗策略以及预后,但是,它不仅可以为患者减少后续的一些昂贵的或者侵入性的检测手段,还可以提供疾病再发风险评估以及为患者及其亲属提供孕前干预或者胎儿的产前诊断。对于一些成年后发病的疾病来说,患者可以在在临床症状出现前对致病性基因突变进行检测,还对有发病风险的兄弟姐妹进行致病基因筛查和预防性治疗来改善临床预后。